GLP-1降糖減肥神藥簡介及純化工藝梳理

近年來，新型降糖藥GLP-1類藥物成為降糖領域重要靶點。GLP-1藥物是降糖減肥的一類重要藥物類別，兼顧降糖、減重成為治療新趨勢，市場火熱，由于其多肽內在屬性決定的相對較高的安全性，將注定成為未來相當長一段時間內降糖減肥藥的翹楚。

GLP-1RA (glucagon-like peptide-1 receptor agonist，GLP-1RA) 是目前重要的降糖減肥藥物之一，可刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌,是美國 DM 協(xié)會和中華醫(yī)學會 DM 學分會推薦的強效降糖藥物^[1-2]。

胰高血糖素樣肽 (glucagon-like peptide，GLP-1)是一種由腸道分泌的內源性肽類激素，可與受體結合促進胰島素分泌，起到生理性降糖作用^[3],GLP-1RA是對 GLP-1 結構進行修飾所得到的，延長了其半衰期，提高了體內活性 GLP-1 水平，使其達到有效濃度，可改善胰島素敏感性、降低血糖、血壓及體質量^［4]。

GLP-1RA 包括艾塞那肽 (exenatide)、利西那肽 (lixisenatide)、利拉魯肽 (liraglutide)、杜拉魯肽 (dulaglutide)、索瑪魯肽(sermaglutide) 及阿比魯肽 (albiglutide) 等^[5]，也可以通過直接延緩胃腸道吸收和刺激迷走神經，抑制胃泌素和進食，減少食物攝入，刺激棕色脂肪組織產熱和白色脂肪組織褐變，增加能量消耗^[6]，進而幫助控制體質量。

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圖1. GLP-1治療對肥胖患者的影響 (Drucker, D. 2021)

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圖2. 利拉魯肽的分類體重減輕摘要(Drucker, D. 2021) ?: p < 0.001，OR: odds ratio，?:糖尿病前期個體，?：低熱量飲食（1200-1400kcal/天），數(shù)據來源^[8-12]。

據不完全統(tǒng)計，國內有20多款適應癥為2型糖尿病的GLP-1類多靶點創(chuàng)新藥在研，其中，恒瑞醫(yī)藥的諾利糖肽均已在III期臨床階段，信達生物/禮來的IBI362、恒瑞醫(yī)藥的HRS9531則處于II期臨床階段。

GLP-1單靶點競爭非常激烈，近一半產品是GLP-1單靶點，單度拉糖肽、司美格魯肽的生物類似藥就十幾個。

據不完全統(tǒng)計，國內有20多款適應癥為2型糖尿病的GLP-1類多靶點創(chuàng)新藥在研，其中，恒瑞醫(yī)藥的諾利糖肽均已在III期臨床階段，信達生物/禮來的IBI362、恒瑞醫(yī)藥的HRS9531則處于II期臨床階段。GLP-1單靶點競爭非常激烈，近一半產品是GLP-1單靶點，單度拉糖肽、司美格魯肽的生物類似藥就十幾個。雙靶點以GLP-1R/GIPR和GLP-1R/GCGR兩類為主，前者國外已有上市產品，國內多處于1期或臨床前階段。后者國外最快3期，國內多處于1期跟隨階段。GLP-1R/FGF21R國內外進度相當，均處于1期研究階段。GLP-1R/GIPR/GCGR三靶點國外進展較快，國內跟進者還較少。GLP-1R/GCGR/FGF21R三靶點目前只有道爾處于臨床1期研究階段^[7]。

已上市的藥物中對GLP-1RA多肽原料的獲取一般用化學合成法或者體外細胞表達。

例如近日已完成III期臨床試驗的常山藥業(yè)艾本那肽藥物則采用的是化學合成法，艾本那肽是一種長效胰高血糖素樣肽-1受體激動劑（GLP-1RA），是常山凱捷健進行研發(fā)注冊的1類創(chuàng)新藥，用于治療2型糖尿病。GLP?1RA通過激活胰高血糖素樣肽-1（GLP?1）受體以葡萄糖濃度依賴的方式刺激胰島素分泌和抑制胰高糖素分泌，同時增加肌肉和脂肪組織葡萄糖攝取，抑制肝臟葡萄糖的生成而發(fā)揮降糖作用，并可抑制胃排空，抑制食欲。采用化學合成艾本那肽，以氨基樹脂為原料，通過逐一縮合的方式，依次連接帶有保護基的氨基酸，后去除樹脂和保護基，沉淀離心得到艾本那肽前體或類似物粗肽。粗肽經過C8填料循環(huán)純化來獲取精肽。

體外細胞表達通常是與白蛋白或者Fc等融合表達。例如泰康生物的GW002采用白蛋白融合技術，GW004采用GLK融合技術，?東方百泰2016年申報CFDA臨床的艾塞那肽-Fc。此外還有在經過GLP-1RA-融合蛋白表達后再經過酶切來獲取相對純的GLP-1RA，其中也可以適當加入標簽方便后續(xù)純化分離工藝。針對融合蛋白表達的GLP-1RA多肽的純化和酶切工藝，要經過膜過濾、鎳親和層析、反相純化等處理，獲得高純度肽-融合蛋白，之后對其進行酶切、純化，即可獲得多肽主鏈，也有利用通過構建載體、轉染等步驟構建工程菌，培養(yǎng)并誘導工程菌融合蛋白包涵體表達，之后通過變性溶解、復性、酶切、親和流穿和離子交換純化等步驟，最終獲得GLP?1及其類似物。

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針對不同的技術模式

采用不同的生產純化方式：

01、表達His標簽-融合蛋白-GLP1RA多肽，多肽-融合蛋白在位酶切和純化的方法，通過鎳親和層析（Ni chromstar FF）方法固定含His標簽的多肽-融合蛋白，在鎳親和層析柱上完成多肽-融合蛋白的在位酶切，一步實現(xiàn)含His標簽的融合蛋白和多肽主鏈的分離，流穿液再通過GST親和層析（Glutathinoe chromstar 4FF）回收腸激酶，反相層析或離子層析（MaXtar Q等）進一步提高純度，獲得多肽主鏈。

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圖3 Ni Chromastar FF純化His蛋白案例

02、針對Fc融合蛋白表達的GLP-1RA多肽的純化工藝，可以通過第一步proteinA親和填料MaXtar ARPA捕獲Fc-多肽，后經過離子層析（MaXtar Q/S/DEAE/SP等）或疏水層析（MaXtar Phenyl/Octyl/Butyl等）進行進一步精純。

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圖4 MaXtar ARPA純化案例

03、針對單純的GLP-1RA多肽的層析純化，可以第一步采用陰離子交換層析（MaXtar Q）對GLP-1類似物進行純化，去除氨基酸缺失雜質，這是反相色譜法難以去除的；第二步層析采用反相色譜法對陰離子純化物質進行純化，去除異構體雜質和副反應雜質。

04、非層析純化，粗肽溶液反相純化得到精肽，調節(jié)pH至3.5-5.5，在-20-25℃析出目標多肽。

05、其他融合蛋白表達的純化工藝：通常采用脫鹽（Puredex G25），離子（MaXtar Q），疏水MaXtar Phenyl/Octyl/Butyl等），藍膠（MaXtar Blue等）不同組合的方式，去除其中蛋白，氨基酸等雜質達到好的分離效果。例：Puredex G25+MaXtar Q+MaXtar Blue。

純化工藝可以根據自己的生產特性選擇不同層析方式、層析順序進行調整，也可增加超濾等步驟來減少下游層析純化壓力。

參考文獻：

[1]American Diabetes Association. Microvascular complications and foot care: standards of medical care in diabetes-2021[J]. Diabetes Care, 2021, 44(Suppl 1): S111-S167.

[2]中華醫(yī)學會糖尿病學分會. 中國2型糖尿病防治指南(2020年版)[J]. 中華糖尿病雜志, 2021, 13(4): 315-409.

[3]Hayes MR, Skibicka KP, Grill HJ. Caudal brainstem processing is sufficient for behavioral, sympathetic, and parasympathetic responses driven by peripheral and hindbrain glucagon-likepeptide-1 receptor stimulation. Endocrinology, 2008, 149(8):4059-4068.

[4]Washington MC, Raboin SJ, Thompson W, et al. Exenatide reduces food intake and activates the enteric nervous system of the gastrointestinal tract and the dorsal vagal complex of the hindbrain in the rat by a GLP-1 receptor. Brain Res, 2010(1344):124-133.

[5] Drucker DJ. GLP-1 physiology informs the pharmacotherapy of obesity. Mol Metab, 2022(57):101351.

[6]Tong J, D'Alessio D. Give the receptor a brake: slowing gastric emptying by GLP-1[J]. Diabetes, 2014, 63(2): 407-409.

[7]https://mp.weixin.qq.com/s/sa_6pD0Al2CmFwf3QdQ_Qg.

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[9]C.W. le Roux, A. Astrup, K. Fujioka, F. Greenway, D.C.W. Lau, L. Van Gaal, et al. 3 years of liraglutide versus placebo for type 2 diabetes risk reduction and weight management in individuals with prediabetes: a randomised, double-blind trial Lancet, 389 (10077) (2017), pp. 1399-1409

[10] M.J. Davies, R. Bergenstal, B. Bode, R.F. Kushner, A. Lewin, T.V. Skjoth, et al. Efficacy of liraglutide for weight loss among patients with type 2 diabetes: the SCALE diabetes randomized clinical trial JAMA, 314 (7) (2015), pp. 687-699

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[12]T.A. Wadden, P. Hollander, S. Klein, K. Niswender, V. Woo, P.M. Hale, et al. Weight maintenance and additional weight loss with liraglutide after low-calorie-diet-induced weight loss: the SCALE Maintenance randomized study International Journal of Obesity, 37 (11) (2013), pp. 1443-1451

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