某獸用亞單位疫苗案例

① His標(biāo)簽未翻譯表達(dá)

解決思路：

? 使用Western blot方法檢測His標(biāo)簽是否表達(dá)

? 重新構(gòu)建目的蛋白分子，改變插入His標(biāo)簽的位置（C端或N端）

② His標(biāo)簽暴露不充分

解決思路：

? 向樣品中加入一定量變性劑（如：3～8 M尿素，3～6 M鹽酸胍等），再上樣純化

? 重新構(gòu)建目的蛋白分子，適當(dāng)增加組氨酸基團(tuán)個數(shù)，或在His標(biāo)簽與目的蛋白之間加入一段Linker

① 介質(zhì)的離子交換作用，導(dǎo)致了非特異結(jié)合

解決思路：

? 在平衡液、樣品、洗脫液中，加入0.5 M NaCl，屏蔽介質(zhì)的離子交換作用

② 雜蛋白也能與金屬離子結(jié)合

解決思路：

? 調(diào)整樣品與介質(zhì)的結(jié)合條件，比如預(yù)先在樣品及平衡液中加入10～50 mM咪唑，屏蔽與介質(zhì)弱結(jié)合的蛋白

? 洗脫過程采用梯度洗脫方法，摸索最佳純度條件

? 嘗試其他金屬離子螯合親和層析介質(zhì)

? 在目的蛋白分子上額外構(gòu)建一個蛋白標(biāo)簽，如：GST標(biāo)簽，兩步純化目的蛋白，或銜接其他純化方法進(jìn)一步純化

③ His標(biāo)簽蛋白被降解

解決思路：

? 細(xì)胞破碎過程中釋放的蛋白酶可能會降解目的蛋白，導(dǎo)致帶有His標(biāo)簽的小片段產(chǎn)生，形成產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，可以在處理樣品過程中加入一定量蛋白酶抑制劑

? 如果目的蛋白自身不穩(wěn)定，會發(fā)生降解，則需要摸索維持目的蛋白穩(wěn)定的最佳條件，包括溫度、緩沖液成分和操作時間等

① 目的蛋白與介質(zhì)結(jié)合能力過強(qiáng)

解決思路：

? 進(jìn)一步增加洗脫咪唑濃度，或同時適當(dāng)降低pH值

? 通過脫落金屬離子，進(jìn)行洗脫，可用pH值3.5條件或EDTA進(jìn)行洗脫

② 目的蛋白沉淀在層析柱內(nèi)

解決思路：

? 摸索維持目的蛋白穩(wěn)定的最佳條件，包括溫度、緩沖液成分和操作時間等

? 適當(dāng)降低上樣量

? 用變性劑洗脫，如8 M尿素或6 M鹽酸胍

① 介質(zhì)長期使用，出現(xiàn)白色

解決思路：

? 如果介質(zhì)長期使用，或單次使用上樣量較大時，會導(dǎo)致介質(zhì)金屬離子脫落，從而導(dǎo)致介質(zhì)變白，可通過介質(zhì)再生解決

? 如果介質(zhì)表面結(jié)合了大量目的蛋白，在純化過程中，會略顯白色，洗脫后顏色會恢復(fù)，屬于正?，F(xiàn)象

② 介質(zhì)在純化過程中，出現(xiàn)棕色

解決思路：

? 介質(zhì)在純化過程中變成棕色，主要是受緩沖液或樣品中還原劑的影響，可以選擇去掉還原劑成分，或者使用Ni Chromstar Excel介質(zhì)

③ 介質(zhì)長期使用過程中，出現(xiàn)黃色

? 介質(zhì)在使用過程中，會積累非特異性吸附的雜質(zhì)，包括蛋白、色素等。同時在層析柱頂端也會積累沉淀蛋白，長期使用后，就會出現(xiàn)介質(zhì)頂端發(fā)黃的現(xiàn)象。此時，往往伴隨著介質(zhì)載量降低、柱效降低、柱壓變大等情況?？赏ㄟ^在位清洗方法，系統(tǒng)的對層析柱進(jìn)行清洗，解決這一問題，并建立合理的介質(zhì)壽命維護(hù)方法