• 縮短開發(fā)周期： 通過并行實驗和自動化技術(shù)，加速工藝參數(shù)優(yōu)化與填料篩選。

• 降低開發(fā)成本：減少樣品和填料的消耗，優(yōu)化資源利用率，降低工藝開發(fā)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

• 提高工藝穩(wěn)健性：通過實驗設(shè)計（DOE）和數(shù)據(jù)分析，明確關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）與關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）的關(guān)聯(lián)性，提升工藝的重復(fù)性和可控性。

• 廣泛的應(yīng)用適應(yīng)性：支持抗體、抗體偶聯(lián)藥物（ADC）、病毒載體，重組蛋白等新型生物藥的純化工藝需求。

• 目標(biāo)產(chǎn)物特性分析：對目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)以及親和力位點進(jìn)行充分評估，如重組蛋白的標(biāo)簽類型、治療性抗體的結(jié)構(gòu)等。

• 填料初選：依據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物特性選擇親和填料類型，如含鎳離子的親和填料用于捕獲含組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白，protein A或protein G親和填料用于捕獲含有完整抗體結(jié)構(gòu)的抗體。

• 初步篩選：選擇3-4款該類型親和填料進(jìn)行篩選，采用平臺化的層析方法，如抗體親和層析通常選用100 mM的乙酸鈉-乙酸/100 mM甘氨酸的緩沖液的洗脫目標(biāo)產(chǎn)物，對目標(biāo)產(chǎn)物的收率以及純度進(jìn)行檢測。

• 工藝優(yōu)化：依據(jù)初步篩選結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行填料優(yōu)化，結(jié)合相應(yīng)的DOE實驗設(shè)計，對上樣、淋洗、洗脫等工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。 

• 確定層析目的與目標(biāo)產(chǎn)物等電點：明確層析目的以及目標(biāo)產(chǎn)物的等電點，目標(biāo)產(chǎn)物的等電點可以通過目標(biāo)產(chǎn)物序列計算獲得，也可以通過毛細(xì)管等電聚焦電泳來獲得。

• 填料與模式選擇：對于等電點低于目標(biāo)產(chǎn)物等電點的雜質(zhì)，可選用陰離子層析-流穿模式進(jìn)行純化；對于等電點高于目標(biāo)產(chǎn)物等電點的雜質(zhì)，通?？刹捎藐栯x子-結(jié)合洗脫的層析模式進(jìn)行純化。

• 篩選方法：流穿模式的填料篩選通常可運(yùn)用DOE結(jié)合96孔板的方式進(jìn)行高通量篩選；結(jié)合洗脫模式的填料篩選首選柱層析篩選的方式。 

• 疏水性預(yù)實驗：通過高鹽梯度預(yù)實驗確定目標(biāo)分子疏水性，結(jié)合梯度洗脫優(yōu)化疏水配基密度，可對目標(biāo)產(chǎn)物的疏水性有一個預(yù)判。

• 上樣鹽濃度優(yōu)化：目標(biāo)產(chǎn)物會在高鹽體系下與疏水性填料進(jìn)行結(jié)合，在低鹽條件下進(jìn)行洗脫，因此需要優(yōu)化層析過程上樣時的鹽濃度，通常選用硫酸銨作為上樣預(yù)處理的鹽。

• 填料篩選：初步確定配基種類和上樣所需的鹽濃度后，可以采用從高鹽到低鹽梯度洗脫的方式進(jìn)行填料篩選和工藝優(yōu)化，后續(xù)可以通過實驗設(shè)計進(jìn)一步優(yōu)化為步級洗脫。

• 分子量評估：首先要對目標(biāo)產(chǎn)物以及雜質(zhì)的分子量有個大致了解，可通過凝膠電泳、毛細(xì)管電泳等方法獲得。

• 填料選擇：主要關(guān)注填料的孔隙直徑范圍，通常來說孔隙直徑越大分離的范圍也就越大，如Geldex^? 75pg的孔隙較小，填料分離范圍在3-70 kda，而Geldex^? 200pg的孔隙較大，填料分離范圍在10-600 kda，因此首先需要根據(jù)純化需求選擇合適的填料。

• 特異性吸附：關(guān)注填料對目標(biāo)產(chǎn)物的特異性吸附作用，應(yīng)盡可能減少目標(biāo)產(chǎn)物與填料的特異性吸附。  

根據(jù)目標(biāo)蛋白的性質(zhì)和純化需求，選擇合適的緩沖液類型，如磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、醋酸鹽緩沖液等。 

對緩沖液的pH值、離子強(qiáng)度、鹽濃度等參數(shù)進(jìn)行梯度設(shè)置，如pH值可設(shè)置為5.5、6.0、6.5、7.0，7.5等，離子強(qiáng)度可設(shè)置為0.1 M、0.2 M、0.3 M等。 

將不同參數(shù)的緩沖液分別用于填料的平衡、上樣、沖洗和洗脫等步驟，通過檢測蛋白的純度、回收率、雜質(zhì)去除率等指標(biāo)，篩選出最佳的緩沖液條件。

如上樣量、流速、洗脫梯度等，這些參數(shù)對純化效果和工藝穩(wěn)定性有重要影響。

采用正交實驗法、單因素實驗法等DOE方法，對關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行組合設(shè)計，確定實驗條件。 

在高通量平臺上進(jìn)行實驗，收集各實驗條件下的純化結(jié)果，分析數(shù)據(jù)，篩選出最佳的工藝參數(shù)組合。

• 分子量：27 kda，

• 等電點：9.90，

• 疏水性適中，

• 通過高通量篩選合適的實驗條件，

• 通過96孔板篩選預(yù)實驗條件。

百林科的填料為MaXtar^? S，SP Chromstar^? FF，MaXtar^? MMC，MaXtar^? MMC HR，MaXtar^? Phenyl HR，MaXtar^? butyl HR。

離子層析緩沖液

A：PB+NaCl, pH7.0, 5 mS/cm；

B：PB+NaCl, pH7.5, 5 mS/cm；

C：PB+NaCl, pH7.0, 7 mS/cm；

D：PB+NaCl, pH7.5, 7 mS/cm；

E：PB+NaCl, pH7.0, 9 mS/cm；

F：PB+NaCl, pH7.5, 9 mS/cm.

G：PB, pH7.0；

H：PB, pH7.5；

I：PB, 0.5 M (NH₄)₂SO_4, pH7.0；

J：PB, 0.5 M (NH₄)₂SO₄, pH7.5；

K：PB, 1 M (NH₄)₂SO₄, pH7.0；

L：PB, 1 M (NH₄)₂SO₄, pH7.5；

M：PB, 1.5 M (NH₄)₂SO₄, pH7.0；

N：PB, 1.5 M (NH₄)₂SO₄, pH7.5.

高通量平臺工藝開發(fā)通過系統(tǒng)化的篩選策略和數(shù)據(jù)分析，顯著提升了生物純化工藝的效率與可靠性。本文提供的策略與案例可為類似項目的工藝開發(fā)提供參考，助力實現(xiàn)高效、低成本的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

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