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純化小技巧 | 99%純度的秘密：BARONHAP® 羥基磷灰石層析介質(zhì)純化技巧大公開

在生物制藥領(lǐng)域，如何高效分離復(fù)雜的生物分子一直是純化工作者的難題。羥基磷灰石（HAP）作為一種獨(dú)特的層析介質(zhì)，憑借其多模式相互作用機(jī)制，成為抗體、疫苗等生物大分子純化的“秘密武器”。本文將帶大家深入了解HAP的純化原理、產(chǎn)品應(yīng)用等方面，揭開其“全能”背后的使用技巧。

純化原理和產(chǎn)品參數(shù)介紹

區(qū)別于傳統(tǒng)介質(zhì)，HAP填料通過其雙位點(diǎn)結(jié)構(gòu)——Ca²⁺和PO₄^3-，融合了陰離子交換、陽離子交換以及金屬螯合等分離機(jī)制。PO₄^3-位點(diǎn)能夠與帶正電的蛋白質(zhì)通過離子鍵結(jié)合，呈現(xiàn)出陽離子交換的特性；而Ca²⁺位點(diǎn)則通過金屬螯合或者是陰離子交換方式與帶負(fù)電的蛋白質(zhì)自由羧基簇結(jié)合。

圖片1.jpg

圖1：結(jié)合原理示意圖

表1.jpg 表 1. BARONHAP^? 參數(shù)表

載量表現(xiàn)

使用CHO細(xì)胞來源的IgG1進(jìn)行載量測試，分子主要結(jié)合表現(xiàn)為磷酸基團(tuán)結(jié)合，BARONHAP? Type I型在結(jié)合載量上更具優(yōu)勢。

壓力流速曲線

圖片3.png

圖2：BARONHAP^? Type I 型

壓力流速曲線（D:300mm*H:20cm）

應(yīng)用案例1

BARONHAP? Type I在抗體項(xiàng)目中有效去除聚體

推薦工藝條件

樣品信息：雙抗陰離子流穿液
層析柱：10*250 mm，20 mL
Buffer A: 20 mM PB, 20 mM Tris，pH 7.2
Buffer A: 20 mM PB, 20 mM Tris，1M NaCl, pH 7.2

圖片4.png

圖3:BARONHAP^? Type I層析圖譜

圖片5.jpg

小結(jié)：BARONHAP^? Type I在雙抗項(xiàng)目表現(xiàn)較好，載量36.9 g/L，純度從91.8%提高到99.5%，聚集體含量由6%下降至0.5%，收率達(dá)到86%。

應(yīng)用案例2

BARONHAP^? Type II, 40 μm在重組因子類的應(yīng)用

8.20 1.png

圖4：BARONHAP^? Type II型洗脫圖譜

8.20 2.png

圖5：進(jìn)口B公司 II型洗脫圖譜

8.20 表.jpg

小結(jié)：較進(jìn)口友商同步對照，性能表現(xiàn)相當(dāng)。

使用技巧大公開

Q1：

裝柱過程的注意事項(xiàng)？

A：

避免使用純水相，需要有一定離子強(qiáng)度的緩沖液裝柱。
柱效測試推薦鹽上樣測試。

Q2：

HAP可以使用什么緩沖液？

A：

常用的結(jié)合緩沖液是用 5 mM 磷酸鹽，pH6.8。堿性蛋白可以用 pH 7.2，含 1 M NaCl 磷酸鹽緩沖液線性或階段洗脫。酸性蛋白可以用 500 mM 磷酸鹽緩沖液線性或階段洗脫。至關(guān)重要的是，不管結(jié)合和洗脫緩沖液 pH 都要高于 pH 6.5.

Q3：

如何延長HAP填料壽命？

A：

在所有緩沖液中，包括貯藏液，建議至少包含 5 mM 磷酸鹽，pH 都要等于或高于 6.5。對于所有應(yīng)用盡量選用高 pH 緩沖液。添加 ppm 級別的鈣離子可以提高填料的堅(jiān)固度。
當(dāng)?shù)谝淮问褂?NaCl 洗脫時，由于氫離子的脫落，將會引起 pH 降低，因此添加 co-buffer，如 MES,將大大提高填料堅(jiān)固度。
用 NaOH 保存柱子阻止碳酸鹽沉淀在柱子表面。
避免突然地改變流速減少壓力沖擊，壓力沖擊將破壞柱床。
堿洗后建議增加高鹽的沖洗，充分熟化。

Q4：

HAP使用壽命和保存效期？

A：

如果正確的裝填，同時維持 pH 高于 6.5， HAP 至少可以使用 40 個循環(huán)。如果小心的避免填料被破壞，HAP可以反復(fù)裝填 20 次或更多。密閉存儲，4-30℃，可以保持 5 年。

Q5：

HAP目前有多大層析柱的放大經(jīng)驗(yàn)？當(dāng)前單批次最大產(chǎn)能？

A：

最大450 mm，裝柱柱高20 cm左右。50 kg。

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