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純化小技巧:疏水填料的影響因素與應用


眾所周知,疏水填料是根據(jù)蛋白表面疏水配基的分布,通過蛋白和層析介質(zhì)疏水表面可逆的相互作用分離物質(zhì)的一種層析方式。由于其在分離純化中優(yōu)異的高聚與低聚的去除表現(xiàn),因此疏水填料在融合蛋白與抗體,ADC等純化中發(fā)揮著重要作用。如何更好的使用疏水填料則離不開對疏水填料的深入了解。


疏水填料影響因素


1. 填料的疏水性能

疏水性是填料選擇中重要的參考數(shù)據(jù),其主要由配基類型(Phenyl>Octyl>Butyl>Butyl-S)、配基密度和基架決定,而疏水性也直接影響目的蛋白的回收率等問題。百林科也對現(xiàn)有主流疏水填料進行了疏水性排序。

圖片4.jpg


圖1:百林科疏水填料疏水性從弱到強排序


2. 鹽溶液的選擇

根據(jù)疏水層析的原理,不同的鹽溶液與鹽溶液的濃度可直接改變分子表面疏水配基的數(shù)量,從而影響目的蛋白與疏水填料的相互作用。因此,緩沖液鹽溶液的選擇一般在初期進行篩選和優(yōu)化。


鹽溶液(洗脫能力):

NaSO4>KH2PO4>Na2HPO4>(NH4)2SO4>K2CO3>Na2CO3>NaCl>NaNO3


3. 溫度的影響

一遍來說溫度升高,疏水作用增加,載量增高;溫度降低,疏水作用降低,載量下降。在工藝開發(fā)過程中,應保持與放大生產(chǎn)的環(huán)境溫度一致,防止溫差過大,工藝放大出現(xiàn)偏移。


4. 添加劑的選擇

在疏水層析過程中,洗脫液中的目的蛋白量較少甚至洗脫不下來的情況,并不少見?;诖?,在洗脫過程中加入添加劑,是常用的一種改善蛋白的溶解度,促進蛋白洗脫的方式。常見的添加劑有有機溶劑(異丙醇、乙二醇等)或者表面活性劑以及氨基酸(精氨酸)等。



疏水填料的應用


應用1

填料名稱:MaXtar? Phenyl HR

柱體積:4.7 mL 

目的蛋白:BsAb (130 mS/cm)      

載量:30 mg/mL

平衡緩沖液:20 mM Tris-HCl,1M (NH4)2SO4 ,pH 7.4  

洗脫緩沖液:20 mM Tris-HCl,pH 7.4 


圖片2.png

圖2:MaXtar? Phenyl HR層析圖譜


表1.jpg

表1:MaXtar? Phenyl HR純化前后 

SEC_HPLC(%)結(jié)果


應用2


填料名稱:Phenyl Chromstar? HP

柱體積:H=15 cm,D=26 mm                

目的蛋白:帶狀皰疹疫苗(VZV)(90-105 mS/cm)     

平衡緩沖液:PBS,0.6 M (NH4)2SO4  

洗脫緩沖液:純化水


圖片3.png

圖3:Phenyl Chromstar? HP層析圖譜

表2.jpg

表2:Phenyl Chromstar? HP純化前后

 SEC_HPLC(%)結(jié)果



小結(jié):

應用1:使用MaXtar? Phenyl HR純化雙抗SEC_HPLC(%)從95.41%提高到99.4%,高聚降低4%,具有顯著的高聚去除效果。


應用2:Phenyl Chromstar? HP 純化帶狀皰疹疫苗后SEC_HPLC(%)達到98%,純化效果顯著。



應用技巧:

1. 疏水填料的選擇

可根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)按照疏水性的不同來選擇疏水配基,若不了解目的蛋白性質(zhì)則可優(yōu)先選擇Phenyl配基進行測試,結(jié)合具體情況,考慮是否更換填料。


2. 上樣緩沖液的選擇

疏水緩沖液中常用鹽溶液為(NH4)2SO4與NaCl,其中(NH4)2SO4一般濃度范圍為0.5-1.5 M (NH4)2SO4 ,而NaCl一般濃度范圍為3 M NaCl以內(nèi),可根據(jù)具體情況選擇鹽溶液。


3. 洗脫過程優(yōu)化

疏水填料進行線性洗脫,根據(jù)洗脫情況進行工藝調(diào)整,若洗脫目的蛋白與雜蛋白分離較好,可嘗試一步洗脫;若分離度較差,可縮小線性范圍,降低坡度,來提高分辨率;若洗脫蛋白較少或較難洗脫則可通過添加劑或者更換鹽溶液進行優(yōu)化。


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