羥基磷灰石包括兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)：Ca²⁺和PO₄^3-。這些結(jié)合位點(diǎn)按照其自有的晶體結(jié)構(gòu)分布。PO₄^3-離子與帶正電的蛋白質(zhì)以離子鍵結(jié)合，具有陽離子交換特性；其中的 Ca^2＋離子與帶負(fù)電蛋白質(zhì)的自由羧基簇以金屬螯合方式結(jié)合。

當(dāng)?shù)鞍讕ж?fù)電荷時(shí)候，可以與 PO₄^3-結(jié)合，而與Ca²⁺是相互排斥，這種作用主要是陽離子交換作用。陽離子交換作用會(huì)受到緩沖液中的中性鹽濃度（如NaCl）。并且隨著 pH 的增高陽離子交換作用也會(huì)相應(yīng)減弱。因此，增加磷酸鹽的濃度或增高 pH，都會(huì)減弱目的蛋白與 PO₄^3-之間的相互作用。

鈣金屬螯合作用

Ca²⁺可以與蛋白或其他分子（如核酸）表面的羧基簇或磷酸基團(tuán)發(fā)生金屬螯合作用，但與 PO₄^3-相排斥。其結(jié)合作用是一般離子交換的 15-60 倍。所以受離子的影響比較小，對(duì) NaCl 不敏感。并且隨著離子強(qiáng)度會(huì)增加鈣金屬螯合力，原因是離子強(qiáng)度的增加可以屏蔽分子表面功能基團(tuán)與 PO₄^3-之間的相互排斥作用。這種結(jié)合方式可以通過磷酸根進(jìn)行洗脫。

HAP剛性強(qiáng)但不可壓縮，不要把柱頭壓進(jìn)填料里，柱頭與柱床底部要留出至少0.1-1cm空隙。整個(gè)層析過程不能反流和反洗。柱子裝好豎直放立，不要倒置和平放。

0.02M PBS,0.15M NaCl,pH7.2–8.0或0.2–0.4M Na₃PO₄/K₃PO₄,pH6.8-10。

注：對(duì)于第一次使用的層析介質(zhì)，裝柱緩沖液不能低于 150mM 離子強(qiáng)度，低于該離子強(qiáng)度可能會(huì)形成渾濁的懸浮液（如圖2）。如果使用高于 150mM 緩沖液，pH 高于 6.8，就會(huì)消除或最大減小這種現(xiàn)象。

計(jì)算裝柱所需層析介質(zhì)體積Vm：Vm=層析柱橫截面積×計(jì)劃裝柱的柱床高度 （注：BARONHAP? 幾乎不溶脹，因此壓縮比可以忽略不計(jì)）。

制備膠懸液：BARONHAP? 層析介質(zhì)為干粉狀。稱取干粉時(shí)，BARONHAP? type I型，建議按照約0.63g/ml計(jì)算；BARONHAP? type II型，建議按照約0.69g/ml計(jì)算。膠懸液比例推薦為30%-50%v/v。

1、用 20% 乙醇為柱底濾膜 ( 篩網(wǎng) ) 排氣。篩網(wǎng)的孔徑應(yīng)≤ 10 μm（填料粒徑40μm）。

2、充分排氣后，在柱底接口處擰上堵頭或關(guān)閉柱底閥，并繼續(xù)注入少量 20% 的乙醇，至覆蓋柱上下柱頭排氣。

3、調(diào)整層析柱至垂直。

4、將柱頭連接至層析系統(tǒng)上，通過層析系統(tǒng)提供低流速，用 20% 乙醇為柱頭濾膜 ( 篩網(wǎng) )排氣。

5、用攪拌棒充分?jǐn)噭蛑苽浜玫膶游鼋橘|(zhì)膠懸液，然后一次性緩慢倒入準(zhǔn)備好的層析空柱中。注：如果膠懸液體積超過空柱容積，應(yīng)使用裝柱器或用連接頭連接另一根空柱管進(jìn)行延長(zhǎng)。

6、將排好氣的柱頭放入層析柱中，充分貼合膠懸液液面，排除所有氣泡。然后擰緊柱頭密封圈。

7、擰開柱底閥，啟動(dòng)系統(tǒng)泵，調(diào)整流速至300cm/h，使用液流壓緊柱床。期間要控制壓力不能超過3MPa。如超壓，需要降低流。

8、待柱床穩(wěn)定后 ( 膠面不再下降 )，標(biāo)記此時(shí)膠面位置。停泵，將柱頭下壓至標(biāo)記位置以上 1-5mm 即可，注意不要讓柱頭壓在層析介質(zhì)上，以防柱頭壓碎介質(zhì)。

9、重新給予步驟 (7) 中的流速，如膠面不再下降，即完成裝柱。若膠面下降，則重復(fù)步驟8-9。

半自動(dòng)柱裝填柱效：6915，AS:0.88

手動(dòng)柱裝填柱效：7100，AS:1.83