壽命驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)需要完全能夠反映商業(yè)化的生產(chǎn)工藝的性能的縮小模型上進(jìn)行，縮小模型可使用工藝表征期間建立和確認(rèn)的縮小模型。研究填料在特定的循環(huán)次數(shù)情況下，通過對(duì)柱效、載量、純度、雜質(zhì)含量、收率等技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以確定填料的使用壽命為商業(yè)化的填料使用壽命提供參考。

一個(gè)典型的層析工藝涉及兩個(gè)主要步驟，層析工藝操作步驟和層析工藝維護(hù)步驟。兩個(gè)步驟的工藝參數(shù)都會(huì)對(duì)其所處理的產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性產(chǎn)生影響，因此，都需要在工藝驗(yàn)證中進(jìn)行驗(yàn)證。

1.同步驗(yàn)證

? 在大規(guī)模上進(jìn)行循環(huán)研究；

? 每隔 n 次運(yùn)行來評(píng)估層析柱性能；

? n+1 運(yùn)行進(jìn)行空白運(yùn)行；

? 最后的 n 個(gè)循環(huán)收獲的樣品進(jìn)行隔離直到檢測(cè)最后的運(yùn)行符合所有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.前瞻性驗(yàn)證

? 在縮小模型上進(jìn)行循環(huán)研究； 

? 每隔 n 次運(yùn)行來評(píng)估層析柱性能；

? 每隔 n+1 運(yùn)行進(jìn)行空白運(yùn)行；

? 一旦在縮小規(guī)模上知道了層析填料壽命，然后在使用合適的安全系數(shù)在大規(guī)模上進(jìn)行驗(yàn)證。

工藝驗(yàn)證之前需要進(jìn)行完成：

? 通過風(fēng)險(xiǎn)分析確定產(chǎn)品的關(guān)鍵屬性 CQA 和關(guān)鍵操作參數(shù) CPP；

? 通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)工藝過程的理解，形成設(shè)計(jì)空間；

? 驗(yàn)證分析方法，校正設(shè)備。

設(shè)備確認(rèn)，方法確認(rèn)，縮小模型驗(yàn)證：

? 用于前瞻性使用壽命研究的設(shè)備儀器的確認(rèn)；

? 建立和確認(rèn)用于前瞻性使用壽命研究的縮小模型；

? 確認(rèn)在縮小模型上層析柱柱效和重新裝填頻次；

? 確認(rèn)在縮小模型上層析操作的關(guān)鍵條件；

? 確認(rèn)在縮小模型上層析介質(zhì)清洗效果；

? 確認(rèn)前瞻性使用壽命研究的原材料控制要求；

? 在縮小模型上建立前瞻性使用壽命研究的檢測(cè)指標(biāo)。

包括動(dòng)態(tài)結(jié)合載量、回收率、對(duì)產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)和工藝相關(guān)雜質(zhì)的去除率，以及層析介質(zhì)自身屬性(如配基密度、粒徑分布、壓力/流速曲線等)。層析填料性能的降低直接影響終產(chǎn)品藥物的安全性和有效性。 

• 該步驟在純化工藝中的位置(捕獲、中度純化或者精細(xì)純化)

• 來料性質(zhì)(各種雜質(zhì)的數(shù)量和種類)

• 層析模式(結(jié)合/洗脫或者流穿模式)

• 層析填料的類型(物理和化學(xué)穩(wěn)定性)

• 維護(hù)(清潔、消毒和保存程序的有效性) 

• 層析柱裝填和損耗(裝填方法和物理穩(wěn)定性)

• 系統(tǒng)組件(層析柱和支持組件的設(shè)計(jì)) 

• 原材料質(zhì)量(原材料中雜質(zhì)的性質(zhì))

• 經(jīng)濟(jì)性(填料成本與驗(yàn)證成本)

建立評(píng)估項(xiàng)目，確定可以接受的壽命：

1. 層析填料和層析柱相關(guān)指標(biāo)：柱效(HETP 和 As)、壓力/流速性質(zhì)、層析填料配基密度等；

2. 層析行為相關(guān)指標(biāo)：UV、pH 和電導(dǎo)層析圖譜、層析收集液體積；

3. 產(chǎn)品評(píng)價(jià)相關(guān)指標(biāo)：包括產(chǎn)品的收率、純化、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)以及工藝相關(guān)雜質(zhì)的殘留、污染物(微生物和內(nèi)毒素)的殘留等；

4. 空白運(yùn)行：相關(guān)雜質(zhì)的殘留(Carryover)。

填料壽命驗(yàn)證時(shí)間：

在工藝確認(rèn)具有大規(guī)模生產(chǎn)批次樣品之后，臨床三期的階段。

• 重復(fù)裝柱：對(duì)填料反復(fù)施壓，以及裝柱壓力控制不當(dāng)。

• 樣品性質(zhì)：樣品澄清度、粘度、酸堿度、成分等。

• 層析工藝：柱床高度、流速及反壓；不同緩沖液類型。

• 維護(hù)保養(yǎng)：不合理的維護(hù)保養(yǎng)，或者對(duì)層析柱不進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)。

  ?
  

? 準(zhǔn)備階段：
1.1 填料法規(guī)支持文件(RSF)、ISO9001 證書、質(zhì)量保證協(xié)議、供應(yīng)商評(píng)價(jià)與審計(jì)。

其中法規(guī)支持文件包括：基本介紹、質(zhì)量體系、產(chǎn)品描述、生產(chǎn)過程、產(chǎn)品質(zhì)量、產(chǎn)品穩(wěn)定性、浸出物、毒理分析、免疫學(xué)性質(zhì)等。

1.2 清潔儲(chǔ)存方法驗(yàn)證

不光能對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行有效去除，還不能對(duì)填料本身性能造成損傷。聽從介質(zhì)供應(yīng)商的建議，參考 RSF 文件。

1.3 設(shè)備確認(rèn)

法規(guī)明確規(guī)定，驗(yàn)證過程中保證設(shè)備正常。非金屬材質(zhì)，具有最高生物安全性；硬件設(shè)備配件材質(zhì)具有完整一致性，可追蹤性；設(shè)備軟件必須具備防止造假功能，真實(shí)有效完整記錄生產(chǎn)過程。

1.4 商業(yè)化生產(chǎn)信息

生產(chǎn)工藝 SOP；樣品性質(zhì)、穩(wěn)定性；層析柱重復(fù)裝填頻率(這個(gè)應(yīng)該在柱效驗(yàn)證中完成)；層析柱性能指標(biāo)、柱效、對(duì)稱性；層析圖譜；關(guān)鍵質(zhì)量屬性、雜質(zhì)、純度；分析方法及檢測(cè)頻率。

? 建立階段：

2.1 建立縮小模型

在小柱子上代表大規(guī)模的性能表現(xiàn)，進(jìn)行壽命驗(yàn)證。保持不變(柱高、線性流速、上樣量/比、緩沖液 CV、梯度體積 CV、收集標(biāo)準(zhǔn))；縮小(直徑、體積流速、樣品體積)。同時(shí)，使用生產(chǎn)原料(所用物料、緩沖液指標(biāo)、上樣料液)，與生產(chǎn)類似層析設(shè)備與操作條件(儀器設(shè)計(jì)一致、材質(zhì)、檢測(cè)器等)以及溫度。

2.2 評(píng)價(jià)參數(shù)

確保縮小模型能反映大規(guī)模生產(chǎn)的性能。主要參數(shù)：HETP、As、小規(guī)模3批與生產(chǎn)規(guī)模3批產(chǎn)品質(zhì)量相關(guān)參數(shù)分析。

2.3 填料壽命評(píng)價(jià)參數(shù)

層析柱的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量、HETP、As、壓力等；層析洗脫峰圖譜、pH 圖譜、電導(dǎo)圖譜等；產(chǎn)品的收率、純度、雜質(zhì)去除效果等；Carry over，符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

?運(yùn)作階段：

3.1 預(yù)期循環(huán)次數(shù)

預(yù)期填料循環(huán) N 次數(shù)，并確定循環(huán) Y 次后進(jìn)行檢測(cè)全檢，其余循環(huán)次數(shù)可取樣不檢或進(jìn)行簡(jiǎn)單檢測(cè)?？瞻走\(yùn)行樣品只進(jìn)行相應(yīng)雜質(zhì)殘留檢測(cè)。

3.2 檢測(cè)方法及樣品保存

根據(jù)樣品確定檢測(cè)項(xiàng)目，及樣品取樣后的保存(防止出現(xiàn)檢測(cè)異常后的回顧與追蹤)。

3.3 開展填料壽命驗(yàn)證試驗(yàn)

層析填料壽命的界定通常指在特定工藝條件下使用過程中，從開始使用時(shí)與設(shè)定的工藝指標(biāo)發(fā)生偏差的使用次數(shù)。并不是所有循環(huán)次數(shù)的樣品都要進(jìn)行全檢，可以每隔 N 次的留樣樣品進(jìn)行全檢，其余的循環(huán)次數(shù)的樣品可進(jìn)行簡(jiǎn)單的檢測(cè)，比如層析圖譜，蛋白濃度，SDS-PAGE 等。空白運(yùn)行的樣品可只進(jìn)行相應(yīng)雜質(zhì)殘留的檢測(cè)。但是，每個(gè)循環(huán)次數(shù)的樣品都要留樣，留樣體積及其保存溫度可參考實(shí)際需求。

Maxtar^? ARPA壽命驗(yàn)證及 CIP 條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：

利用含有 FC 融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清，對(duì)Maxtar^? ARPA 親和層析介質(zhì)進(jìn)行了100個(gè)循環(huán)的不同 CIP 條件及壽命實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。其中，CIP  條件見表1。

表1：不同的 CIP 再生條件

在100個(gè)循環(huán)試驗(yàn)內(nèi)回收率在90%以上的初始水平，見圖1。

圖1：壽命驗(yàn)證-3組實(shí)驗(yàn)的回收率變化曲線

具有優(yōu)異的 HCP 去除能力及較低的 protein A 脫落，樣品的 SEC-HPLC 純度較高，見圖2。

在整個(gè)壽命驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，Maxtar^? ARPA 在抗體純化應(yīng)用中表現(xiàn)了較高的穩(wěn)定性。

圖2：不同 CIP 方案的 HCP 去除，protein A 脫落，SEC 等性能比較

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