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純化小技巧 | Heparin 親和填料應(yīng)用指南和使用小技巧分享

Heparin 親和是將肝素共價(jià)偶聯(lián)到瓊脂糖基架上而制成的親和層析介質(zhì)肝素是一種天然存在的多糖硫酸酯，與多種生物分子具有親和作用，也可以作為離子交換配體使用。該層析介質(zhì)可用于分離純化凝血因子、抗凝血酶 III、生長因子、干擾素、脂蛋白脂肪酶以及核酸和類固醇受體的酶等。

其主要特性包括：

基于共價(jià)偶聯(lián)的特性，具有較高化學(xué)穩(wěn)定性，配基不易脫落。
高度的選擇性和親和力，尤其對(duì)抗凝血酶 III，非特異性吸附低。
廣泛應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域，具備完整的法規(guī)支持文件。

肝素親和填料主要純化應(yīng)用領(lǐng)域

截至目前，各類研究發(fā)現(xiàn)肝素與上百種蛋白具有親和作用，因此肝素親和填料廣泛應(yīng)用于血漿蛋白、病毒和病毒顆粒、DNA 結(jié)合蛋白、以及乳鐵蛋白等純化過程。

血漿蛋白

抗凝血酶 Ⅲ 的純化應(yīng)用：肝素親和填料能夠特異性地結(jié)合并分離抗凝血酶 Ⅲ，這是一種重要的血漿蛋白，具有強(qiáng)大的抗凝血作用。通過肝素親和填料純化得到的抗凝血酶 Ⅲ 可用于治療血栓性疾病。

凝血因子的純化應(yīng)用：肝素親和填料也可用于分離和純化凝血因子，如人凝血因子 IX、XI 和 VIII 等，這些凝血因子在血液凝固過程中起著關(guān)鍵作用。

病毒及病毒樣顆粒

肝素參與病原體感染過程，與多種病毒有親和特性，因此可以用于病毒疫苗和病毒載體的純化?；诟嗡赜H和層析配基的結(jié)構(gòu)與硫酸肝素蛋白聚糖相似性，肝素親和層析可用于 AAV2 型的分離純化。此外，肝素親和填料也用于單純皰疹病毒、偽狂犬病毒、HIV-1 gag VLPs 等的純化。

DNA 結(jié)合蛋白

在與 DNA 結(jié)合蛋白質(zhì)間的相互作用中，Heparin 可以模擬核酸的多陰離子結(jié)構(gòu)，與核酸結(jié)合蛋白產(chǎn)生特異性親和作用。利用這一特性，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子、核酸酶等的純化。

乳鐵蛋白

在合適的工藝條件下，乳鐵蛋白與肝素通過離子鍵發(fā)生結(jié)合作用，故肝素親和填料也可用于純化乳制品中的乳鐵蛋白。

應(yīng)用實(shí)例分享——血漿中純化抗凝血酶 III

建議工藝條件：

Column：Heparin Chromstar^? FF (D:1.6 cm*H:20 cm)
Sample：AT III
Buffer A：20 mM PB，0.1 M NaCl，pH 7.2
Buffer B：20 mM PB，2 M NaCl，pH 7.2

小結(jié)：對(duì)肝素親和后洗脫樣品進(jìn)行檢測，回收率和比活均符合預(yù)期。

使用 Tips

在使用肝素親和填料過程中，為平衡親和作用和離子交換兩種作用，結(jié)合緩沖液中通常加入較低濃度的鹽。既可以降低非特異性吸附，又不影響離子交換作用。而洗脫方式通常利用離子交換的特點(diǎn)，使用 1.5 M-2 M 的NaCl、KCl 或硫酸銨洗脫。
肝素本身在低 pH 不穩(wěn)定，使用時(shí)應(yīng)該避免 pH＜4 的條件。
后處理建議使用 2 M NaCl 清洗離子結(jié)合蛋白，可以使用 6 M 鹽酸胍或 8 M 尿素清洗沉淀或變性蛋白，使用非離子去污劑清洗疏水結(jié)合蛋白，避免使用離子型去污劑。

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