質(zhì)粒是一類能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立于染色體外自主復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的雙鏈超螺旋DNA分子，經(jīng)過改造后可以接入外源DNA作為基因載體，或者轉(zhuǎn)染細(xì)胞包裝病毒載體，以及作為DNA疫苗或者mRNA體外轉(zhuǎn)錄的模板等。不管是基因治療，核酸疫苗或者mRNA 模板，質(zhì)粒都按照較高的GMP生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行工藝的設(shè)計與開發(fā)，并且系統(tǒng)性的優(yōu)化質(zhì)粒的上下游方案，以便獲得高產(chǎn)和高質(zhì)量的質(zhì)粒產(chǎn)品。

下圖展示了百林科可以提供的質(zhì)粒整體解決方案，包含上游的發(fā)酵培養(yǎng)以及下游的純化處理等工藝需求。本文將重點介紹微生物發(fā)酵過程中的關(guān)鍵影響因素以及優(yōu)化策略，百林科一次性生物反應(yīng)器系列的設(shè)計與優(yōu)勢，典型的質(zhì)粒發(fā)酵應(yīng)用案例。

質(zhì)粒表達(dá)與發(fā)酵的關(guān)鍵因素

一般來講，決定質(zhì)粒的表達(dá)以及質(zhì)量水平通常跟菌株的選擇，質(zhì)粒載體的設(shè)計與構(gòu)建以及培養(yǎng)基配方，補(bǔ)料策略以及發(fā)酵條件設(shè)計，發(fā)酵過程監(jiān)控以及放大策略等有較大關(guān)系。

01、發(fā)酵菌株的選擇：選擇適合質(zhì)粒表達(dá)的菌株是成功實現(xiàn)高效表達(dá)和大規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵。菌株的選擇應(yīng)基于多個因素，包括目標(biāo)基因的特性、菌株的生長速度、代謝特點、耐受性和表達(dá)能力等。目前大腸桿菌中Top 10 & DH5a 常用于質(zhì)粒的表達(dá)。

02、載體的設(shè)計與構(gòu)建：根據(jù)目標(biāo)基因的特性和表達(dá)需求，進(jìn)行合理的質(zhì)粒載體設(shè)計。常見的質(zhì)粒載體包括原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體。

03、發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化：發(fā)酵培養(yǎng)基配方不同對菌體生長和質(zhì)粒表達(dá)性能會有顯著影響。通過配方優(yōu)化，提供適當(dāng)?shù)奶荚础⒌?、無機(jī)鹽和輔助因子等營養(yǎng)物質(zhì)，以滿足菌體代謝需求和質(zhì)粒穩(wěn)定復(fù)制。

04、培養(yǎng)條件的優(yōu)化：其中溫度、pH值、溶氧濃度和攪拌速度等參數(shù)會顯著影響發(fā)酵結(jié)果。這些條件的優(yōu)化需要結(jié)合菌株特性和質(zhì)粒表達(dá)要求，通過溫度的調(diào)整，可以實現(xiàn)較高的生長速度和表達(dá)效率。通過調(diào)整通氣量和攪拌速度來調(diào)整溶氧，以滿足菌體不同階段的代謝需求。

05、過程監(jiān)控與控制：建立全面的發(fā)酵過程監(jiān)測系統(tǒng)可以協(xié)助實現(xiàn)高效表達(dá)和穩(wěn)定產(chǎn)量。一般包括在線或離線監(jiān)測生物量、溶解氧濃度、pH值、營養(yǎng)物濃度以及產(chǎn)物積累等關(guān)鍵參數(shù)。通過對監(jiān)測數(shù)據(jù)的實時分析和控制策略的調(diào)整，可以優(yōu)化發(fā)酵過程的效率和穩(wěn)定性。

06、放大策略：放大過程中需要考慮發(fā)酵罐的尺寸選擇、通氣設(shè)備和攪拌系統(tǒng)的設(shè)計，以及相關(guān)的操作流程和控制策略。此外，放大過程中應(yīng)注意擴(kuò)散和傳質(zhì)問題，以保證質(zhì)粒表達(dá)的均一性和穩(wěn)定性。

綜上所述，要實現(xiàn)高效表達(dá)和大規(guī)模生產(chǎn)，需選擇適合的菌株和質(zhì)粒載體，優(yōu)化培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件，建立監(jiān)測與控制系統(tǒng)，并結(jié)合合理的放大策略。這些步驟需要深入研究、實驗驗證和優(yōu)化，并最終應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中。

百林科CytoLinX?BR 系列生物反應(yīng)器

在質(zhì)粒發(fā)酵上的主要優(yōu)勢如下

1、高氧傳輸效率

BR生物反應(yīng)器采用了先進(jìn)的氣體傳輸技術(shù)和設(shè)計，可以提供優(yōu)異的氧氣溶解度和氣體液體傳質(zhì)性能，確保菌體在發(fā)酵過程中得到充足的氧氣供應(yīng)。

2、優(yōu)化的溫度和pH控制

BR生物反應(yīng)器配備了高精度的溫控和pH控制系統(tǒng)，能夠精確控制發(fā)酵過程中的溫度和pH值，提供理想的環(huán)境條件，以最大程度地促進(jìn)細(xì)菌生長和質(zhì)粒表達(dá)效率。

3、靈活的體積調(diào)節(jié)

BR生物反應(yīng)器具有靈活的體積調(diào)節(jié)能力，可以適應(yīng)不同規(guī)模的質(zhì)粒發(fā)酵需求。通過添加或移除可互換的工作容器單元，可以快速實現(xiàn)反應(yīng)器體積的變化。這種可伸縮的設(shè)計使得BR生物反應(yīng)器非常適合從實驗室中的小規(guī)模研究到工業(yè)化生產(chǎn)的大規(guī)模應(yīng)用。

4、全自動化控制系統(tǒng)

BR生物反應(yīng)器配備了全自動化控制系統(tǒng)，能夠?qū)崟r監(jiān)測和控制關(guān)鍵參數(shù)，如溫度、pH值、溶解氧濃度和攪拌速度等。通過這個系統(tǒng)，用戶可以對發(fā)酵過程進(jìn)行精確的調(diào)節(jié)和優(yōu)化，提高質(zhì)粒表達(dá)的效率和穩(wěn)定性。

5、方便的操作和樣品采集

BR生物反應(yīng)器的設(shè)計注重操作的便利性和樣品采集的方便性。人性化的用戶界面，提供直觀的操作指導(dǎo)和信息顯示。還提供了方便的樣品采集接口，使得用戶可以隨時獲取發(fā)酵樣品進(jìn)行分析和評估。

綜上而言，百林科的CytoLinX? BR 生物反應(yīng)器通過高氧傳輸效率、優(yōu)化的溫度和pH控制、靈活的體積調(diào)節(jié)、全自動化控制系統(tǒng)以及方便的操作和樣品采集，BR生物反應(yīng)器能夠提供穩(wěn)定、高效的質(zhì)粒發(fā)酵環(huán)境，幫助實現(xiàn)質(zhì)粒表達(dá)的最佳結(jié)果。目前CytoLinX? BR MO微生物反應(yīng)器最大可放大至50L。

培養(yǎng)條件優(yōu)化與控制：使用CytoLinX?BR生物反應(yīng)器進(jìn)行小規(guī)模質(zhì)粒發(fā)酵試驗。通過對溫度、pH值、氧氣傳輸和攪拌速度等操作參數(shù)的優(yōu)化，提供了最適宜的環(huán)境條件以促進(jìn)菌體生長和質(zhì)粒表達(dá)。通過全自動化的監(jiān)測和控制系統(tǒng)，實時跟蹤關(guān)鍵參數(shù)如溫度、pH值、溶解氧濃度和營養(yǎng)物濃度等。通過對監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和調(diào)整，及時控制發(fā)酵過程，以保證質(zhì)粒表達(dá)的效率和穩(wěn)定性。

? 溫度：37℃，變速補(bǔ)料（流速達(dá)到最大）開始后，調(diào)整溫度為35℃。

? 氧氣傳輸率（OTR）：攪拌速度：200-360rpm；通氣量：1.0-2.0vvm。

? pH值：定期監(jiān)測并調(diào)整，初期7.0，12h后調(diào)整為7.2。

? 補(bǔ)料策略：營養(yǎng)物流速（NFR）：依據(jù)比生長速率調(diào)整；加料時間點（Feed timing）：OD600＞25開啟。

? 反饋控制：pH：7.0-7.2；DO：40%。

表1 培養(yǎng)條件優(yōu)化與控制一覽表

圖4 CytoLinX?BR 生物反應(yīng)器培養(yǎng)（E.Coli）過程

工藝放大：在小規(guī)模試驗成功后，研究人員將發(fā)酵條件和操作參數(shù)進(jìn)行了相應(yīng)的放大，通過增大工作容器單元的數(shù)量或調(diào)整反應(yīng)器尺寸，實現(xiàn)了相應(yīng)的發(fā)酵規(guī)模擴(kuò)大。

圖5 CytoLinX?BR 50L生物反應(yīng)器優(yōu)化后培養(yǎng)（E.Coli）過程

采用百林科的CytoLinX?BR生物反應(yīng)器，該團(tuán)隊成功實現(xiàn)了目標(biāo)質(zhì)粒的高效表達(dá)條件優(yōu)化與生產(chǎn)放大。

圖 6 CytoLinX?BR生物反應(yīng)器培養(yǎng)OD600展示

表2 工藝優(yōu)化后產(chǎn)量對比